细胞冻存&复苏小知识

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在科幻小说三体中描写过一种低温休眠技术，通过将人体冷冻在极低温度的环境下，使人体代谢停滞或减慢，等待了数个世纪以后，再用高科技术将处在冬眠状态下的人唤醒。

在现实中，当前的科学技术虽然还难以达到科幻小说中冻存完整个体的水平，但对于像胚胎、干细胞、精子、组织切片等生物样本的冻存复苏，是完全可行的。

由于细胞等样本对温度很敏感，冻起来的过程较为简单，但冻好，并在使用时保持高复苏活性却不是一件容易的事。其中的难点在于，当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，而冰晶的产生会大大降低细胞的活性。

那么，在冷冻过程使用什么办法才能减少细胞损伤呢？

冰晶的形成与降温速率密切相关，冷冻速率太快或太慢，都容易导致细胞内的水分形成大冰晶，不利于细胞存活。

因此，在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不会产生大的冰晶。相反，细胞在快速投入液氮罐的过程中会因降温速率过快，细胞内的水分来不及渗透到细胞膜外面，就形成大量的冰晶，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，致使细胞复苏率降低。

慢冻快融是大家在细胞冻存和复苏时一直遵守的原则。

慢冻可使细胞逐步脱水，且细胞内不会产生大量冰晶，快融则是为了使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，同时防止小冰晶形成大冰晶，导致冰晶的重结晶，从而对细胞造成损害。

对于绝大多数哺乳动物细胞，1℃/min的降温速率是较合适的冻存速度，适用于细胞疗法中的T/NK等免疫细胞及MSCs等干细胞的冻存。

研究发现，慢速降温时（1℃/min甚至更低）冰晶的结构较大且均衡，无论复苏的速率多少，冰晶结构都没有明显变化，但快速降温时（10℃/min），冰结构表现出高度非晶形，表现为更细微的树突状结构，在复苏过程更容易形成再结晶，尤其接下来以较低加热速率（6.2℃/min或更低）复苏时，就很容易出现再结晶的现象，从而对细胞造成损害，影响细胞生物学活性。但用较高速率复苏快速降温（10℃/min）的细胞样品，冰晶没有足够时间形成再结晶，这是快融可以避免再结晶对细胞造成损害的原因。

科研探索中常使用的程序降温盒，采用的是梯度降温的方法。像安进特梯度降温盒，在没有酒精及任何液体的情况下，能确保在低温冰箱中样品的降温速率为-1℃/min，可以运用于各种细胞类型，包括干细胞，原代细胞盒细胞系。使用方法便捷，只需插入冷冻管，然后在放入-80℃的环境中即可。不仅能大大提高使用者的工作效率及保存细胞的存活率，对于研究人员及样本来说也更为安全省心。

安进特梯度降温盒采用的是新型材料设计及核心冷却技术，无需预冷，直接使用，节能环保。适配1.5ml、2.0ml冻存管，降温速率一致，细胞复苏性能稳定且成活率高。

梯度降温盒

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图片来源：安进特

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